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            口蹄疫免疫抗體檢測經典方法詳述

            時間:2022-08-06    點擊: 次    來源:中農威特    作者:李永霞 - 小 + 大

            國際糧農組織(FAO)、世界動物衛生組織(WOAH)和我國農業農村部發布的《國家動物疫病監測與流行病學調查計劃(2021-2025)》,推薦用口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測方法對口蹄疫免疫效果進行評價。

            一、液相阻斷ELISA實驗原理

            液相阻斷ELISA 實驗原理是抗原抗體在液相中反應,病毒抗原與稀釋好的被檢血清首先在液相中反應,然后抗原抗體復合物和沒有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原被轉移到包被了口蹄疫特異性抗體的ELISA板中,沒有完全被血清抗體阻斷的病毒抗原被ELISA板中的抗體捕獲,再通過酶結合物與底物顯色10~15 min,最后加入終止液進行讀數??贵w滴度以阻斷50%病毒抗原的血清稀釋度表示。

            二、液相阻斷ELISA特點

            1、優勢

            口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測方法專為檢測FMD全病毒抗體設計,是針對完整病毒粒子的抗原位點進行抗體定性定量檢測,通過對被檢血清的倍比稀釋,定量測定血清中抗體含量的高低。液相阻斷ELISA與中和試驗的原理相似,又被稱為體外病毒中和試驗,克服了病毒中和試驗無法在臨床檢測中推廣應用的缺點,適用于大批量樣品的血清學調查。同時,口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測技術具有良好的敏感性、可重復性,與攻毒保護有很好的相關性,現被廣泛應用于口蹄疫免疫抗體水平的監測。

            2、劣勢

            液相阻斷ELISA操作步驟較多,耗時較長,對實驗檢測人員技術性、熟練性和操作性要求較高。

            三、液相阻斷ELISA的操作細節及注意事項

            1、樣品的保存及使用

            全血樣品采集后應盡快分離血清避免溶血,500~4000 rpm 離心 5~10 min;若無離心條件,可將全血樣品在室溫下(20℃)傾斜放置2~4小時(依室溫而定),或4~8 ℃環境中過夜待其自然凝固,然后轉移上清液于新管待測。血清 0~4 ℃條件下可保存5 d,如采用 -15~-20℃ 冷凍保存時間更長。冷凍保存血清樣品需在4~8 ℃條件下解凍,再平衡至室溫,稀釋前需充分混勻。

            2、試劑的回溫及孵育

            (1)試劑回溫

            試劑盒中的試劑,包括包被用的反應板,在使用前應恢復至室溫,將其提前拿出放置1~2 h平衡至室溫(20~25℃),冬季可置于 25℃左右的恒溫培養箱內回溫。

            (2)加樣孵育

            每次加樣后反應板必須用封板膜封嚴,否則會造成水分過多蒸發,影響實驗結果;反應板盡量均勻放置于孵育箱,不可重疊放置,以免傳熱不均勻。在孵育時,實驗操作者一般習慣將ELISA板放入溫箱即開始計時,沒有考慮ELISA板孔內溫度升至37℃尚需一定的時間,這樣容易造成實際測定中溫育時間不夠,因此實驗時需根據具體室溫情況可適當增加ELISA板在溫箱中的孵育時間。

            3、不同批次試劑盒的使用

            不同批次試劑盒中的每種試劑成分都被優化和作為一個整體工作,為了使實驗結果準確,避免使用不同批次的試劑成分,尤其是病毒抗原,不同批病毒抗原的工作濃度不同,因此不能隨意亂用,要對應于相同批次試劑盒中的各種成分使用,同時要避免反復凍融病毒抗原,可將其先進行小體積封裝-20 ℃保存(-40 ℃保存效果更好),每次實驗時按需取封裝抗原。

            4、試劑的配制

            配制試劑前后都要充分混勻,濃縮的PBST液在低溫下會有無機鹽結晶析出,使用前可水浴或恒溫培養箱融化,用無離子水或超純水做25 倍稀釋。底物溶液按操作說明配制,現配現用。

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